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技術文章
TECHNICAL ARTICLES
更新時間：2024-05-14
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利用形態測量學來確定細胞形態的變化，可以被視為篩選潛在藥物和有毒物質的一種令人興奮的工具，可以區分兩種主要的細胞死亡模式。
在細胞凋亡和壞死過程中，治療的早期階段會發生劇烈的細胞體積變化。從生物物理學和治療學的角度來看，區分這些過程非常重要。細胞凋亡是一種程序性的細胞死亡過程，而壞死則是由于環境干擾而導致的意外死亡。當治療引起細胞凋亡而非壞死時，往往會有更好的結果。此外，細胞增殖過程會導致細胞體積的變化，作為細胞生長的一個衡量標準。
在這項研究中，我們展示了非侵入性的形態表面分析技術與經過良好評估的生化方法相匹配，能夠清晰區分生理細胞和病理細胞。簡而言之，形態測量分析可以通過適當的納米顆粒（NPs）誘導的細胞體積變化作為增殖和細胞死亡的前兆，與傳統方法測量的細胞存活反應相兼容。
這個項目本質上是跨學科的，因為它需要對不同材料及其與感興趣的生物實體的相互作用進行表征，正如團隊成員具有不同背景所示。由Ferrari博士領導的小組旨在研究液體-固體界面上兩親分子的潤濕過程、吸附和聚集，制備高度抗液體潤濕的涂層，并利用AFM和3D形態測量技術進行表征。由Morán博士領導的小組專注于控制釋放系統的開發以及其在2D（體積和底物）和3D條件下的體外表征。
使用S neox 3D輪廓儀是因為它具有分析大面積和從掃描中獲取重要表面參數的能力。采用了ISO 25178標準對表面進行了形態測量的表征，該標準提供了對表面紋理進行三維參數評估的規則。
在Confocal模式下，對包含在研究條件下的細胞的個體蓋玻片的整個表面進行了分析。選擇了特定區域的細胞，并使用SensoSCAN S neox軟件分析了高度（H）和長度（L）上的相應剖面。相應的形狀因子（SP）是根據H/L值確定的。
光學掃描形貌測量技術相對于原子力顯微鏡（AFM）具有多重優勢：非侵入性和非破壞性的表征，以及能夠分析較大表面而不受限于幾平方厘米。此外，與AFM技術的已有經驗相比，測量時間也減少了[2, 3]，使光學形貌測量成為一種在納微尺度上提供更高分辨率的顯微技術，提供更多定性和定量信息。盡管對于這種技術不需要熒光蛋白標記物或光學活性染料，但共焦和干涉模式下的三維掃描形貌測量可以在細胞幾何參數評估方面提供高準確性（圖1a）。因此，標準條件下的3T3纖維母細胞顯示出典型的雙極或多極結構，呈細長形狀。此外，類似上皮細胞的HaCaT、HeLa和A431細胞呈多邊形形狀，尺寸更加規則，以離散斑塊的形式生長。由于納米粒子處理，3T3纖維母細胞呈橢圓形狀，沒有須突。上皮細胞之間邊界喪失，形狀不規則。
通過對得到的剖面進行分析（圖1b），從定量的角度評估了幾個結構參數，例如對照細胞的高度和長度，以及經過增殖和細胞毒性誘導處理的細胞。
細胞形態及其形狀因子在不同H/L比值下的變化總結如圖2a和圖2b所示。通過使用球冠模型作為細胞的幾何近似[5]，估算了細胞的體積（圖2c）。所得數值與直接使用SensoSCAN S neox軟件測量的細胞邊緣考慮在內的數值相吻合（在所有情況下差異低于5%）。
圖2：共聚焦模式下的三維表面形貌圖像（20倍放大）和形態參數（L：長度和H：高度）（a），形狀因子（H/L比值）數值（b），以及根據光學表面形貌剖面數據和使用球冠模型作為細胞的幾何近似所估算的細胞體積。結果表示為十個獨立細胞的平均值±標準偏差。*p<0.001表示與對照細胞存在顯著差異，*p<0.001表示相同細胞系的不同處理之間存在顯著差異，≠p<0.001表示相同處理下不同細胞系之間存在顯著差異。（“3D profilometry and cell viability studies for drug response screening" by M. C. Morán, F. Cirisano and M. Ferrari is licensed under CCC）。
利用光學表面形貌測量，對細胞形態進行了分析，并且具有與MTT細胞存活檢測等常規方法相兼容的響應時間[6]。然而，這些分析可以避免由于MTT作用而導致的代謝活性變化而不改變可存活細胞數量的一些矛盾結果。此外，細胞存活率的測量結果來自每毫升104-105個細胞的代謝活性的算術平均值。這么多的細胞數量可能會阻礙對細胞形態變化在非常早期階段或細胞群體中的小部分的確定。
通過三維表面形貌測量確定單個細胞的體積是建立細胞死亡模式或機制的附加價值，這是其他技術（平方厘米級別）無法簡單檢測到的。這項技術可以被視為在篩選潛在藥物和毒性材料時觀察細胞形態變化的有趣工具，特別是在治療過程中非常短的時間內，對細胞死亡的兩種主要模式進行區分，以提前預測治療藥物的成功預期。
生物醫學研究的成功在于將納米材料應用于疾病治療并開發用于診斷的工具。在這項工作中，3D光學表面形貌測量通過定性和定量分析，滿足了作為潛在治療或毒性藥物傳遞系統篩選工具的要求，促進細胞生長或誘導細胞死亡。這項工作是研究團隊**結合這兩個學科（治療和診斷）進行的發表。
Sensofar的光柵投影技術能夠有效地分析微觀尺度上的功能紋理。因此，我們可以通過快速和非破壞性的測量獲得確保功能紋理正常工作的結果。
借助S wide，我們可以通過SensoVIEW添加有關幾何形狀的所有詳細信息，并在報告中進行總結，從而提供出色的質量控制。S wide還能克服一些典型的光柵投影系統的限制，因為我們可以測量拋光表面。
參考文獻
[1] M. C. Morán, F. Cirisano, M. Ferrari. 3D profilometry and cell viability studies for drug response screening. Mat. Sci. Eng. C. 115(2020) 111142
[2] E. Guzmán, L. Liggieri, E. Santini, M.Ferrari, F. Ravera, F. Mixed DPPCcholesterol Langmuir monolayers in presence of hydrophilic silica nanoparticles. Colloids Surf B. Biointerfaces. 105 (2013) 284-293.
[3] J.L. Rinn, C. Bondre, H.B. Gladstone, P.O. Brown, H.Y. Chang. Anatomic demarcation by positional variation in fibroblast gene expression programs. PLoS Genet. 2 (2006) e119.
[4] M.C. Morán, J. Carazo, M.A. Busquets.Dual responsive gelatin-based nanoparticles for enhanced 5-fluorouracil efficiency. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 172 (2018) 646-654.
[5] J.A. Hessler, A. Budor, K. Putchakayala, A. Mecke, D. Rieger, M.M B. Holl, B.G.Orr,A. Bielinska, J. Beals, J.J. Baker. Atomic force microscopy study of early morphological changes during apoptosis. Langmuir 21 (2005) 9280-9286.
[6] T. Mosmann. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65 (1983) 55-63.